내부 매개변수 준비 방법
내부 참조 준비 방법: WB는 조작이 간단하고 발현 산물을 정성적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 목적 단백질 양의 상대적인 변화도 표시할 수 있습니다. 활성 생물학적 거대분자로서 항체와 항원 사이의 반응은 상대적으로 복잡하므로 발현 산물을 측정하는 데 사용할 때 어느 정도 불확실성이 있습니다. 따라서 WB 실험 설계에 좋은 참조 시스템을 추가하는 것은 실험 결과 분석에 매우 도움이 됩니다. 참조 시스템에는 일반적으로 분자량 마커(단백질 밴드에 해당하는 분자량을 결정하는 데 사용됨), 공백 벡터 제어(유도된 발현 시스템인 경우 유도 전 제어도 있어야 함), 양성 제어가 포함됩니다. 알려진 양의 표준 제품 및 내부 참조.
내부 참조는 가장 쉽게 간과되는 항목입니다. WB를 사용하여 다른 조건이나 다른 조직에서 대상 단백질의 상대적 발현을 비교하려는 경우 동일한 양의 세포를 로드하면 다음의 기초가 제공됩니다. 비교. 특히 발현 수준이 높지 않은 경우 샘플 로딩의 차이가 결과 분석에 영향을 미칠 가능성이 높으므로 이때 내부 참조가 특히 중요합니다.
내부 참조는 내부 참조(내부 대조)입니다. 포유동물 세포 발현의 경우 일반적으로 하우스키핑 유전자에 의해 암호화되고 발현되는 단백질(하우스키핑 단백질)이 다양한 조직 및 세포에서 비교적 일정하게 발현됩니다. . , 단백질 발현 수준의 변화를 감지할 때 참고 자료로 자주 사용됩니다. WB 실험에서는 단백질 추출, 단백질 정량화, 동량의 단백질 로딩 및 전기영동, 막 전달, 표적 단백질 항체 배양, 발색 및 기타 단계 외에도 단백질 정량화 및 로딩을 수정하기 위해 내부 참조 검출도 필요합니다. 프로세스에 존재하는 것은 실험 결과의 정확성을 보장합니다.
단백질 농도 측정은 다양한 샘플 간의 로딩량을 비교하는 가장 좋은 방법입니다. 그러나 다양한 단백질 농도 정량 방법에는 한계가 있으며 다양한 시료의 정확한 단백질 농도를 정확하게 결정할 수 없습니다. 예를 들어, UV 방법은 직접 정량화에 적합하며, 이는 상대적으로 단일 성분으로 구성된 상대적으로 순수한 단백질을 테스트하는 데 적합합니다. 비색 방법에 비해 작업은 간단하지만 DNA 및 DNA와 같은 평행 물질의 간섭을 받기 쉽습니다. 민감도가 낮고 더 높은 단백질 농도가 필요합니다. 단백질 농도를 측정하는 비색법에는 일반적으로 BCA, Bradford, Lowry 및 기타 방법이 포함됩니다. BCA 방법과 Lowry 방법 모두 단백질과 세제 간의 간섭에 취약합니다. Bradford 방법은 Lowry 및 BCA 반응을 방해하는 다양한 환원제(예: DTT, 메르캅토에탄올)에 가장 민감하고 호환됩니다. 그러나 여전히 세제에 민감하다는 점은 표준이 다르면 동일한 샘플의 결과에 큰 차이가 발생하여 비교할 수 없다는 것입니다. 또한, 단백질 정량 후 전기영동 시 동일한 양의 시료를 로딩해야 하며, 이 단계에서도 조작상의 오류가 발생합니다. WB 실험 중에 내부 컨트롤을 사용하면 정량화 및 로딩 단계로 인해 발생한 오류를 쉽게 수정할 수 있습니다.
WB에서 내부 컨트롤을 사용한다는 것은 실제로 내부 컨트롤에 해당하는 항체를 사용하여 WB 프로세스 중에 내부 컨트롤의 발현을 감지할 수 있음을 의미합니다. 다양한 조직과 세포에 내부 대조 물질이 존재하기 때문에 발현이 비교적 일정하며, 각 시료에서 내부 참조량을 검출하여 로딩 오류를 수정할 수 있어 반정량적 결과의 신뢰성이 더욱 높습니다. 또한 내부 참조는 단백질 전달 조건이 올바른지, 전체 WB 발색 또는 발광 시스템이 정상적인지 여부를 확인하기 위한 공백 대조로 사용할 수 있습니다.
실험 결과 분석은 실제로 매우 간단합니다. 샘플의 단백질 양이 제한되어 한 번의 전기 영동 전달 실험에만 충분할 경우 샘플의 내부 기준량과 목적 단백질 양을 별도로 측정합니다. . 각 샘플의 목표 단백질 양을 내부 참조 함량으로 나눕니다. 얻은 값은 내부 참조 수정 후 각 샘플의 목표 단백질 함량을 비교 및 분석하여 목표 단백질 함량을 얻는 데 사용됩니다. 다른 샘플 사이의 실제 변경 결과. 샘플량이 충분할 경우 먼저 내부 참조를 테스트하고 내부 참조의 색상 밴드가 샘플 간에 일치하는지 관찰한 후 차이에 따라 각 샘플의 로딩량을 조정하고 Western Blotting 실험을 다시 수행할 수 있습니다. 내부 기준량이 일치할 때까지, 내부 기준량이 일치하면 서로 다른 샘플 간의 표적 단백질 발현 변화 분석을 진행할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 단백질 내부 참조에는 GAPDH(글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소) 및 세포골격 단백질 베타-액틴 또는 베타-튜불린이 포함됩니다.